چكيده مطالعات. و in vitro. تلفن/ نمابر: پست الكترونيك:

Transcript

1 مجله ديابت و ليپيد ايران. پاييز و زمستان 1381 دوره 2 (شماره 1): 3-25 مقاله پژوهشي بررسي تركيبات گليكوزيله نهايي آلبومين سرم (AGE) در افراد ديابتي به روش ايزوالكتريك فوكوسينگ (IEF) و فلورسانس جهت ارزيابي پيشرفت بيماري ديابت منوچهر نخجواني: مركز تحقيقات غدد و متابوليسم دانشگاه علوم پزشكي تهران بيمارستان وليعصر (عج) بيژن فرزامي : گروه بيوشيمي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران تقي گل محمدي: گروه بيوشيمي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران اكبر جعفرنژاد: كارشناس ارشد گروه بيوشيمي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران چكيده مقدمه: گليكوزيلاسيون غيرآنزيمي پروتي نها در ديابت ميتواند آثار مخربي بر ساختمان و كاركرد پروتي ينها داشته باشد. برپايه مطالعات و in vitro in vivo گليكوزيلاسيون غيرآنزيمي پروتي ينها و تركيبات گليكوزيله نهايي آنها در ايجاد عوارض ماكروواسكولار مانند آترواسكلروز و نيز آثار ميكروواسكولار از قبيل رتينوپاتي و نفروپاتي اهميت دارد. روشها: برخي ويژگيهاي بيوشيميايي و فيزيكي آلبومين گليكوزيله مانند تحرك الكتروفورتيك فلورسانس و ph ايزوالكتريك در تشكيل وابسته به زمان تركيبات گليكوزيله نهايي مورد بررسي قرار گرفت. همچنين براي نخستين بار از روش ايزوالكتريك فوكوسينگ براي بررسي گليكوزيلاسيون آلبومين سرم افراد ديابتي و مقايسه آن با افراد سالم استفاده شد. يافتهها: تحرك الكتروفورتيك آلبومين گليكوزيله پس از 1 هفته انكوباسيون با گلوكز نسبت به آلبومين طبيعي %21/3 افزايش نشان داد. ph ايزوالكتريك آلبومين از 4/6 در روز اول به 4/1 در هفته هفتم كاهش يافت. افزايش تحرك الكتروفورتيك همراه با كاهش در ph ايزوالكتريك در هفته اول مشاهده گرديد. اين تغييرات به خوبي با تغييرات مشاهده شده در فلورسانس همبستگي داشت. محتواي گلوكز نمونههاي آلبومين نگهداري شده تا هفته اول انكوباسيون كاهش يافت اما پس از هفته دوم به تدريج افزايش نشان ميداد. اندازهگيريهاي فلورسانس نيز با اين روند تغييرات همخواني داشت. در بررسي با روش ايزوالكتريك فوكوسينگ اختلاف معنيداري بين آلبومين سرم افراد ديابتي و آلبومين سرم افراد طبيعي مشاهده شد (/= p). نتيجهگيري: افزايش تحرك الكتروفورتيك پس از هفته اول همراه با كاهش همزمان در ph ايزوالكتريك نشاندهنده آن است كه تشكيل تركيبات گليكوزيله نهايي پس از هفته اول آغاز ميشود. كاهش غلظت گلوكز طي هفته اول و افزايش متعاقب آن پس از هفته دوم را ميتوان به تشكيل و هيدروليز تركيبات گليكوزيله نهايي نسبت داد. شايد بتوان از اين روش براي شناسايي وضعيت پايدار ديابت يا درجه پيشرفت آن استفاده كرد. كليدواژهها: تركيبات گليكوزيله نهايي (AGE) آلبومين گليكوزيله ديابت قندي ايزوالكتريك فوكوسينگ (IEF) فلورسانس نشاني: گروه بيوشيمي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران صندوق پستي تلفن/ نمابر: پست الكترونيك: bfarzami@neda.net

2 26 تركيبات گليكوزيله نهايي آلبومين سرم در ديابت مقدمه ديابت قندي نقص متابوليكي با مشخصه بارز افزايش مزمن گلوكز خون است كه موجب اختلال در متابوليسم مواد سهگانه (كربوهيدراتها ليپيدها و پروتي ينها) ميگردد. افزايش مزمن قند خون عامل اصلي عوارض ثانويه ديابت است. با وجود اين گزارشهاي متعددي وجود دارد كه نقش گليكوزيلاسيون غيرآنزيمي پروتي ينها را در پاتوفيزيولوژي ديابت نشان ميدهد( 1 ). در گليكوزيلاسيون غيرآنزيمي پروتي ينهايي كه واجد گروههاي آمين آزاد نظير گروه اپسيلون آمين ليزين هستند در ph فيزيولوژيك بهصورت غيرآنزيمي با گروههاي كتوني يا آلوييدي قندهاي احياكننده واكنش داده تركيبات ناپايدار آلدامين را تشكيل ميدهند. اين محصولات طي چند ساعت در اثر بازآرايي (rearrangement) بيشتر به محصولات پايداري به نام تركيبات آمادوري (Amadori) تبديل ميشوند( 2 ). تركيبات آمادوري طي دو واكنش متوالي دهيدراتاسيون و قطعه قطعه شدن به تركيبات آلفا ديكربونيل تبديل ميگردند. اين تركيبات نسبت به قندهاي اوليه براي واكنش با پروتي ينها فعالتر هستند لذا با ايجاد پيوند عرضي بين پروتي ينها تركيبات ناهمگوني به نام تركيبات گليكوزيله نهايي AGE) ( 1 پديد ميآورند (3). انباشت اين تركيبات كه بهطور برگشتناپذير تشكيل ميشوند به القاي آسيبهايي در بدن منجر ميگردد( 3 ). يكي از پروتي ينهاي مهم بدن كه متحمل فرايند گليكوزيلاسيون غيرآنزيمي ميشود آلبومين سرم است. آلبومين حدود %6 پروتي ينهاي پلاسما را تشكيل ميدهد و حاوي نقشهاي مهمي از جمله حفظ فشار اونكوتيك و انتقال بيومولكولهاي درونزاد (آندوژن) و برونزاد (اگزوژن) است( 4 ). بررسيها نشان دادهاند كه در سرم افراد ديابتي غلظت آلبومين گليكوزيله و تركيبات AGE افزايش مييابد( 5 ) و ويژگيهاي فيزيكي - شيميايي اين پروتي ينها از جمله پيوند آن به بيومولكولها دستخوش تغيير ميگردد( 6 ). در اين مطالعه برخي از پارامترهاي بيوشيمايي آلبومين گليكوزيله نظير حركت الكتروفورتيك تغييرات گسيل (emission) فلورسانس و ph ايزوالكتريك را در محيط دادهايم. in vitro با اطلاعات بهدست آمده از مطالعات مورد بررسي قرار in vitro تغييرات آلبومين سرم افراد ديابتي و سالم با روش ايزوالكتريك فوكوسينگ مورد بررسي قرار گرفت. با توجه به افزايش بيرويه جمعيت كشور و روند افزايش شهر نشيني در چند سال آينده توجه و برنامهريزي براي تشخيص پيشرفت ديابت جهت پيگيري و درمان اين بيماري از اولويتهاي مهم كشوري است لذا انجام پژوهشهايي مانند مطالعه حاضر جهت برنامهريزي در استفاده از روشهايي كه بتوانند وضعيت پايدار بيماري ديابت را ارزيابي و آثار مداخلات درماني را در جلوگيري از پيشرفت آن شناسايي نمايند از اهميت خاصي برخوردار است. روشها 1- روش گليكوزيلاسيون آلبومين سرم انساني HSA) ( 2 در شرايط (7) in vitro آلبومين سرم %2 از فرآوردههاي سازمان انتقال خون ايران تهيه گرديد. گلوكز (شركت سيگما) به غلظت /5 مولار در محلول HSA با غلظت 5 mg/ml تهيه شد. سپس مقدار %/2 (W/V) سديمآزيد و %/1 جنتامايسين به بافر اضافه گرديد. همزمان با تهيه محلول فوق مخلوط كنترل حاوي تمام اجزاي مخلوط HSA بهجز گلوكز تهيه شد و محلول در تاريكي و دماي º c اين محلولها در فواصل زماني معين حجم برداشت نموده و در 37 نگهداري شد. از 2-7 º c قرار داديم. ميليليتر در پايان زمان انكوباسيون تمامي نمونهها براي آزمايشهاي مربوط مورد استفاده قرار گرفت. 2- الكتروفوروز ژلپليآكريلآميد 3 PAGE به روش (8) Davis و در سيستم بافريتريس گليسين انجام گرديد. بافر جدا كننده در ph بافر متراكم كننده ph و 6/7 ph = 8/9 تنظيم گرديد. جريان ميليآمپر در مدت سه ساعت برقرار شد و در حرارت c الكتروفورز انجام گرديد. 2 Human serum albumin 3 Polyacrylamide gel electrophoresis 1 Advanced glycated end-products

3 28 مجله ديابت و ليپيد ايران. پاييز و زمستان 1381 دوره 2 (شماره 1) 3- ايزوالكتريك فوكوسينگ براي اين منظور از ژلهاي آماده با دامنه 3/5 ph 9/5 استفاده شد (شركت فارماسيا). ژلها در تانك الكتروفورز افقي نصب شدند و جريان الكتريكي به صورت ذيل برقرار شد. 15 دقيقه 2 ولت 3 دقيقه 3 ولت 3 دقيقه 4 ولت 24 ساعت 5 ولت يك ساعت 75 ولت. 4- اسپكتروفلوي ورومتري اهميت بهكارگيري اين روش در حساسيت آن است. بهطوريكه مقادير كم در حد نانوگرم را نيز ميتوان از اين طريق شناسايي و اندازهگيري كرد. با اين روش تركيبات AGE را در طول موج برانگيختگي λ exc = 37 nm و طول موج تابش λ emiss = 44 nm ميتوان اندازهگيري نمود( 7 ). 5- اندازهگيري گلوكز اين اندازهگيري از طريق سنجش آنزيمي با آنزيم گلوكز اكسيداز انجام گرفت (شركت زيستشيمي) يافتهها نمونههاي شاهد مقايسه گرديد. باندهاي نمونههاي آلبومين گليكوزيله نسبت به نمونههاي آلبومين پهنتر و روشنتر بودند و تحرك بيشتري نيز از خود نشان دادند. مهاجرت نسبي آلبومين گليكوزيله نسبت به آلبومين از فرمول زير محاسبه گرديد. ميزان حركت آلبومين گليكوزيله 1 = مهاجرت نسبي ميزان حركت آلبومين غيرگليكوزيله شكل 1 درصد نسبي تغييرات مهاجرات آلبومين گليكوزيله به آلبومين سرم در مدت هفت هفته انكوباسيون آلبومين با گلوكز 2- فلورسانس از آنجا كه محصولات AGE بهعلت ساختمانهاي ايجاد شده خود داراي خواص فلورسانس ميباشند. گسيل فلورسانس نمونههاي قندي و شاهد در طول موج 44 نانومتر قراي ت گرديد كه مقادير اختلاف آن با شاهد در شكل 2 نمايش داده شده است. با توجه به نتايج بهدست آمده از تعيين مقدار گلوكز آزاد در نمونههاي گليكوزيله ملاحظه ميشود كه نمونهها از روز چهارم به بعد كاهش معنيداري را پيدا كردهاند كه اين كاهش تا هفته سوم ادامه دارد و سپس افزايش يافته به حد اوليه خود ميرسد. -1 الكتروفورز PAGE در الكتروفورز نمونههاي آلبومين سرم حاوي قند با Per cent difference Days of incubation شكل 1 درصد نسبي تغييرات مهاجرت آلبومين گليكوزيله به آلبومين سرم در مدت هفت هفته انكوباسيون آلبومين با گلوكز.

4 28 تركيبات گليكوزيله نهايي آلبومين سرم در ديابت 3- ايزوالكتريك فوكوسينگ در ايزوالكتريك فوكوسينگ IEF) ( 1 محدوده پيدايش باند آلبومين در هفته اول در ph ايزوالكتريك آلبومين معادل 4/6 بود كه در طي سه مرحله اندازهگيري شد. در هفتههاي سوم پنجم و هفتم بهتدريج كاهش معنيداري در phi ايجاد گرديد و مقدار نهايي آن در هفته هفتم به 4/1 رسيد (شكل 3 ). 4- ايزوالكتريك فوكوسينگ نمونههاي آلبومين سرم افراد ديابتي و سالم در مرحله بعد 16 نمونه سرم ديابتي شامل 8 نمونه ديابتي با قند خون كنترل شده با مشخصات ديابت نوع 2 با مدت ابتلا به بيماري حدود 1 سال كه تحت درمان با انسولين بودهاند و گلوكز ناشتاي آنها 25-2 ميليگرم در دسيليتر بود و 8 نمونه سرم ديابتي با قند خون كنترلنشده با 1<HbA 1c انتخاب شدند. تعداد 16 نمونه سرم سالم نيز بهعنوان شاهد مورد استفاده قرار گرفتند. نتايج حاصل از IEF سرمهاي ديابتي و سالم نشان داد كه ph ايزوالكتريك آلبومين در افراد ديابتي در مقايسه با افراد سالم كاهش معنيداري (. = p) نشان ميدهد (شكل.(4 بحث بررسي تركيبات گليكوزيله نهايي (AGE) در بيماران ديابتي از آن جهت حاي ز اهميت است كه اين تركيبات كمپلكسهاي پروتي يني گليكوزيله متفاوتي ايجاد ميكنند كه بهنظر ميرسد در ايجاد عوارض ديررس بيماري ديابت از قبيل آنژيوپاتي رتينوپاتي ميوپاتي و كاتاراكت دخالت داشته باشند. شناسايي و بررسي اين تركيبات و كمپلكسهاي پروتي يني گليكوزيله را ميتوان معياري براي ارزيابي پيشرفت بيماري ديابت قرار داد. همچنين شناسايي مواد و روشهايي كه قادر به جلوگيري از تشكيل مواد فوق باشند ميتواند در جلوگيري از پيدايش عوارض ديابت بهكار گرفته شود. در اين بررسي براي نخستينبار با استفاده از روش ايزوالكتريك فوكوسينگ و فلورسانس برخي از ويژگيهاي تركيبات گليكوزيله نهايي مشخص گرديد. نتايج حاصل از الكتروفورز AGE و ايزوالكتريك فوكوسينگ نشان داد كه در نتيجه ايجاد تركيبات AGE آلبومين سرم ديابتي در زمانهاي انكوباسيون طولانيتر افزايش حركت الكتروفورتيكي بيشتري نسبت به آلبومين سرم طبيعي دارد. (شكل 1 ). كاهش ph ايزوالكتريك نيز در اين مدت (هفت هفته) ايجاد گرديد (شكل 3 ). بدين ترتيب بهنظر ميرسد كه در اثر گليكوزيلاسيون بارهاي مثبت ليزين در آلبومين كه هدف اصلي تركيب قند در واكنشهاي گليكوزيلاسيون ميباشد كاهش مييابند و در ph مورد نظر نسبت كلي بارهاي منفي افزايش مييابد. نتايج حاصل از فلي وريمتري نشان ميدهد كه تشكيل فراوردههاي چهارم آغاز ميشود AGE بعد از روز (شكل 2 ) و در هفته دوم به حداكثر مقدار خود ميرسد ولي بعد از هفته دوم كاهش فلورسانس كه مبين كاهش تركيبات AGE است تا هفته پنجم ادامه مييابد. اندازهگيري قند در نمونههاي مورد آزمايش نشان ميدهد كه در اين مدت مصرف قند جهت ايجاد تركيبات گليكوزيله افزايش دارد (شكل 2 ) (اين تغييرات با كميات منفي در مقايسه با مقدار قند موجود در زمان صفر نشان داده شده است). در هفته پنجم مقدار قند به حد طبيعي خود برميگردد. در مطالعات ايزوالكتريك فوكوسينگ كه بر روي سرم افراد ديابتي انجام گرفت مشخص گرديد كه PHi مربوط به آلبومين در سرم افراد ديابتي كاهش قابلتوجهي نشان داده است (شكل 4 ). در اين خصوص ميتوان از ميزان ph ايزوالكتريك آلبومين سرم افراد ديابتي در مقايسه با سرم افراد سالم همراه با الگوي الكتروفورتيك پروتي ينهاي سرم به روش ايزوالكتريك فوكوسينگ در شناسايي درجه پيشرفت بيماري ديابت بهعنوان معياري ثابت استفاده كرد.. 1 Isoelectric focusing

5 28 مجله ديابت و ليپيد ايران. پاييز و زمستان 1381 دوره 2 (شماره 1) 12 1 insulin alone insulin + quillaja 8 Mean Time (min) شكل 2- تغييرات نسبي فلورسانس تركيبات AGE در مدت 7 روز انكوباسيون استريل با قند كميات منفي مربوط به كاهش مقدار قند اضافه شده نسبت به زمان صفر است Mean ** insulin alone Time (min) insulin + sodium cholate شكل 3- تغييرات همزمان افزايش تحرك الكتروفورتيك آلبومين در طي 49 روز انكوباسيون استريل با گلوكز با تغييرات ph ايزوالكتريك در ايزوالكتريك فوكوسينگ Mean % starting glucose concentration (mg/dl) insulin alone insulin+acanthophyllum insulin+quillaja insulin+sodium cholate Time (min) شكل 4- مقايسه نمونههاي سرم ديابتيك با سرم افراد سالم در ايزوالكتريك فوكوسينگ

6 3 تركيبات گليكوزيله نهايي آلبومين سرم در ديابت مĤخذ 1. Friedman EA. Advanced glycosylated end products and hyperglycemia in the pathogenesis of diabetic complications. Diabetes Care 1999; 22: Brownlee M. Glycation and diabetic complications. Diabetes 1994; 43: Yim MB, Cheolju L. Creation of catalytic sites for free radical generation. Annals of the New York Academy of Sciences 21; 928: Peters T Jr. Serum albumin. Advance in Protein Chemistry 1985; 37: Dolhofer R, Wieland OH. Glycosylation of serum albumin: elevated glycosyl albumin in diabetic patients. FEBS Letters 1979; 13: Shaklai N, Garlick RL, Bunn HF. Nonenzymatic glycosylation of human serum albumin alters its conformation and function. Journal of Biological Chemistry 1984; 259: Wu JT, Tu MC, Zhung P. Advanced glycation end product (AGE): characterization of the products from the reaction between D-glucose and serum albumin. Journal of Clinical Laboratory Analysis 1996; 1: LKB Laboratory Manual. Vertical Electrophoresis; 21.